18052091425
Tunel染色
Tunel染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。
技术原理
晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下，将带有生物素(Biotin)分子的dUTP，标记到DNA的3'-末端，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素Streptavidin(Streptavidin-HRP)结合，最后通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是Tunel(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法检测细胞凋亡的原理。
实验流程
关键实验步骤
1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60?C 20min，再用使用二甲苯两次5-10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚�。≡竦鞍酌竗的孵育时间，常用10-30min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3.适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37?C1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。
4.DAB显色条件的选择。一般DAB反应10min左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。
5.PBS的充分清洗。在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6.内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
实验结果展示：
注意事项
1、洗涤蛋白酶K时，一定要PBS冲洗3次，如果冲洗不净会严重干扰后续的标记反应；
2、3%的过氧化氢溶液孵育时间不应过长，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，产生假阳性；
3、滴加Tunel检测液时，可利用防蒸发膜防止其蒸发影响样本的生物素标记；配制好的DAB显色液必须一次性使用完毕，不宜冻存。
常见问题
无/弱染色？
烤片温度过高，推荐56℃-60℃1-2h；
一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。
染色过深？
染色试浓度过高或孵育时间过长；
显色剂浓度过高或孵育时间过长。
送样运输要求：
1、石蜡切片常温、组织由标准的石蜡包埋盒包埋，石蜡与组织要均匀接合，不能有裂痕；蜡块厚度根据所需切片的数量而定，有效厚度至少要超过0.1cm。尽量提供半年内的组织蜡块，超过半年的蜡块抗原可能丢失，做免疫组化可能出现检测不到蛋白。
2、冰冻切片-20℃、固定后细胞爬片4℃。
